Vznik a jej príčiny: Huntingtonova choroba je autozomálne dominantne dedičná choroba so 100% penetranciou. Má variabilnú expesivitu, t.j. funkčnosť génu závisí od pohlavia rodiča. Relatívne neskorší vek začiatku a miernejší priebeh je pri prenose od matky. Mutácia je na krátkom ramienku štvrtého chromozómu. Ide o multiplikáciu (viac ako 39 opakovaní) CAG (cytozín, guanín, adenín) tripletu v géne IT-15. Lokus bol zmapovaný v r.1983 a gén izolovaný v roku 1993. Produktom mutácie je exces glutamínových sekvencií: 46-62 (norma je 11-34), na ktoré sa viaže proteín huntigín a pravdepodobne v dôsledku tejto poruchy jeho funkcie dochádza k neurodegenerácií . Selektívne sú apoptózou postihnuté GA BA-ergické neuróny v podkôrových štruktúrach – striáte. Obrázky A,B,C: Obrázok A ukazuja normálnu nervovú bunku Obrázok B – nervová bunka „nainfikovaná“ genetickým materiálom, ktorý produkuje chybný proteín HD Obrázok C ukazuje čo sa po čase s bunkou stáva LABORATÓRNA DIAGNOSTIKA: VYUŽITIE MOLEKULÁRNO-GENETICKÝCH METÓD Pri ochoreniach s predpokladanou expanziou tandemovým opakovaní trinukleotídov (Huntingtonova chorea, spinobulbárna svalová atrofia, syndróm fragilného X-chromozómu) sú vyšetrenia indikované na základe klinického nálezu. Indikácia pri väčšine metabolických ochorení je až na základe biochemického nálezu a vyšetrením sa zistí typ mutácie. U niektorých porúch tohto typu je molekulárno-genetická diagnostika spoľahlivejšia a jednoduchšia ako požadované biochemické vyšetrenia. Polymerázová reťazová reakcia - PCR (Polymerase Chain Reaction) predstavuje metódu, ktorá sa úspešne realizuje v molekulárno-biologických laboratóriách v nadväznosti s požiadavkami praxe. Jej výhodou je exaktnosť, vysoká citlivosť, reprodukovateľnosť a pomerne jednoduchá praktická realizovateľnosť. PCR umožňuje amplifikáciu - zmnoženie špecifických úsekov DNA in vitro polymerizáciou pri využití špecifického katalytického účinku DNA-polymerázy. Rozmnoženie sa realizuje cyklickým opakovaním celého procesu. PCR imituje prirodzený mechanizmus replikácie DNA, ktorý sa v organizme uskutočňuje počas každého cyklu delenia bunky. V priebehu niekoľkých hodín je možné získať jedno až niekoľkomiliónové zmnoženie hociktorého úseku DNA, ktorého sekvencia báz, alebo aspoň sekvencia obidvoch jeho koncových častí je známa (inak by nebolo možné zhotoviť primery ) Táto metóda spôsobila v molekulárnej genetike revolúciu,pretože je geniálne jednoduchá, veľmi rýchla a veľmi citlivá. Autorom metódy je Karry Mullis z firmy CETIS a do komerčnej podoby bola prepracovaná kolektívom pod vedením Henriho Erlicha. PODSTATA PCR Na uskutočnenie PCR je treba mať k dispozícií : -vzorku DNA obsahujúcu sekvenciu s GI, ktorá sa má amplifikovať a chemicky vizualizovať, -primery – štartéry, -termostabilnú DNA polymerázu Taq Tento druh polymerázy bol izolovaný z baktérie Thermus aquaticus, žijúcej v horúcich prameňoch a odtiaľ pochádza aj jej označenie Tag DNA polymeráza. -prekurzory DNA – štyri deoxynukleozid trifosfáty dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ktoré predstavujú základné stavebné jednotky pre syntézu -pufer na vytvorenie slabo zásaditého prostredia, ktoré je nevyhnutné pre aktivitu DNA poly Taq Princíp DNA amplifikácie spočíva v cyklickom opakovaní troch krokov, ktorými sú : 1. Denaturácia - oddelenie obidvoch komplementárnych reťazcov daného úseku DNA zahriatím na 94°C 2.Hybridizácia (50°C) – naviazanie dvoch komplementárnych primerov po jednom na 3´ koniec obidvoch reťazcov rozmnožovaného úseku, získaných pri denaturácii. Primermi sú synteticky pripravené jednovláknové oligonukleotidy, ktoré majú sekvenciu komplementárnu k sekvenciám na 3´ konci obidvoch vlákien. Skladajú sa približne z 20 nukleotidov. Pomocou nich sa rozmnožovaný úsek DNA ohraničuje, čím umožní identifikáciu a súčasne slúžia ako štartéry na začatie 3. kroku. 3.Syntéza chýbajúceho komplementárneho úseku DNA (72°C) – jej začiatok predstavujú primery, od ktorých sa vlastná syntéza odvíja pripájaním jednotlivých komplementárnych nukleotidov. Syntéza prebieha pri optimálnej teplote 72°C. Priebeh ďalších cyklov umožňuje opakovanie sledu uvedených teplôt (94°C, 50°C, 72°C), pričom novosyntetizované vlákna DNA slúžia ako materiál pre ďalšiu syntézu v nasledujúcich cykloch. Po približne 30 cykloch sa takto získa okolo 105 kópií PCR-produktu – vymedzeného úseku DNA. Reakcie prebiehajú v termocykleroch, ktoré nastavujú optimálnu teplotu pre jednotlivé kroky. Produkt PCR (amplifikovaný úsek DNA) sa detekuje elektroforeticky a vizualizuje sa priamo farbením (napr. striebrom), alebo pomocou hybridizácie so sondami značkovanými rádioizotopicky či farebne. VÝHODY A NEVÝHODY PCR Medzi výhody PCR, pre ktoré našla uplatnenie v medicíne patrí: 1.krátke trvanie celého vyšetrovacieho procesu (okolo 3 hodín), čo má veľký význam pre prenatálnu genetickú diagnostiku (výsledok je k dispozícii najneskôr 2. deň po dodaní vzorky). 2.veľká citlivosť – napr. odhalenie jedinej bunky infikovanej vírusom. 3.potreba malého množstva DNA – rádovo nanogramové množstvá, čo umožňuje napr. predimplantačnú diagnostiku z jedinej blastoméry, diagnostiku z buniek vlasovej cibulky a dokonca i z jednej spermie alebo somatickej bunky. 4.Vyšetrovaná DNA môže byť veľmi stará a značne degradovaná, takže možno použiť aj farebné chromozómové preparáty, parafínové bločky tkanív, zmrazené tkanivá (takto sa vyšetrila mitochondriálna DNA sibírskeho mamuta, zamrznutého pred 40 000 rokmi v Severnom ľadovom mori, alebo aj veľmi staré vzorky múmií, starých až 7 000 rokov. V týchto prípadoch sa tiež vyšetrila mitochondriálna DNA.